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Annexin V是一种分子量为35～36kD的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine)高亲和力特异性结合。以标记了FITC的Annexin V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

Propidium iodide(碘化丙啶，PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能透过细胞膜而使细胞核红染。Annexin V与PI配合使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。

• 为保证得到理想的实验结果，在使用此试剂盒之前请认真阅读该注意事项；
  
• 试剂（尤其是小瓶装的试剂）在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落；
  
• 碘化丙啶能通过皮肤吸收，对眼睛有刺激作用；
  
• 此试剂盒仅供科研使用，不宜用于临床诊断；
  
• 本试剂盒中提供的PBS为随试剂赠送，并非试剂盒的真正组成成分；细胞的洗涤同常规方法。

• 整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞，尽量在4℃下操作；
  
• 反应完毕后请尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应1小时后荧光强度就开始衰变；
  
• FITC和碘化丙啶是光敏物质，在操作时请注意避光；
  
• 成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上磷脂酰丝氨酸的密度、发生凋亡时磷脂酰丝氨酸翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间等，把这些影响因素进行优化对实验成功是非常必要的；
  
• 在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留，有可能会影响实验结果；
  
• PI染色时间过长有可能造成检测的凋亡率偏高，建议首先进行Annexin V-FITC染色，上机前5分钟再加入PI染色。

• 贴壁细胞，先用胰酶消化；
  
• 细胞计数后取5×10⁵～1×10⁶个/mL细胞，1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；
  
• 加入1mL冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮；
  
• 1000rpm，4℃离心10分钟，弃上清；
  
• 重复步骤3、4两次；
  
• 将细胞重悬于200μL结合缓冲液；
  
• 加入10μL Annexin V-FITC轻轻混匀，避光室温反应15分钟或4℃反应30分钟。
  
• 加入300μL结合缓冲液（总反应体积500μL）以及5μL PI染色液，在1小时内上机检测；
  
  • 建议在加入PI染色液之前将细胞悬液用200目筛网过滤。
• 若用荧光显微镜检测，将细胞混合液离心，取细胞沉淀涂片，再进行观察。